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HPV Analyser

Molekularbiologische Methoden

Wir verwenden unterschiedliche molekularbiologische Methoden, die uns bei der Differentialdiagnostik und Suche nach Vorstufen des Gebärmutterhalskrebses unterstützen (HPV - und immunzytochemische Nachweismethoden). Der Einsatz dieser Methoden ist nur bei auffälligem Pap-Abstrich oder bei Zustand nach operativem (operativen) Eingriff(en) am Gebärmutterhals wegen CIN I bis CIN III sinnvoll.

Nachweis von Humanen Papillomviren (HPV) mittels RT-PCR (Real-time Polymerase-Kettenreaktion)

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Erfassung der HPV-Typen mit  BD ViperTM LT-System
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Erfassung der HPV-Typen mit BD ViperTM LT-System

Bei dem BD Onclarity TM HPV-Test der Firma Becton Dickinson, der auf dem BD Viper TM LT-System ausgeführt wird, handelt es sich um einen HPV-Test zum simultanen Nachweis von 14 Hochrisiko (HR)-HPV-Genoytpen. Der Test ermöglicht den Einzelnachweis für sechs der wichtigsten HR-HPV-Genotypen (16, 18, 45, 31, 51 und 52). Zusätzlich erfasst er drei HR-HPV-Subgruppen (33/58, 56/59/66 und 35/39/68) und deckt damit die wichtigsten onkogenen HR-HPV-Genotypen ab.

 

Zur Identifikation werden genotypenspezifische Primer und Sonden verwendet. Die Zielsequenz sind die Proteine E6 und E7 des HPV. Diese Onkogene tragen zur malignen Progression bei, indem sie durch eine Überexpression eine zunehmende Instabilität des Genoms der Wirtszelle bewirken1. Zusätzlich erfüllt er die klinisch-internationalen Richtlinien (Meijer Kriterien) für HPV-Nachweisverfahren2.

Es sind keine Kreuzreaktivitäten mit LR-HPV-Genotypen bekannt. Der Test hat eine FDA-Zulassung und ist CE-IVD zertifiziert.

 

Abbildung 2: Detektion der E6 / E7 - Region
Abbildung 2: Detektion der E6 / E7 - Region

Qualitativer Nachweis von E6 / E7 - HPV-DNA

Der BD OnclarityTM HPV-Test ist ein qualitativer Nachweis von Hochrisikotypen der humanen Papillomaviren (HPV), der auf die Erkennung der  E6 / E7 - Region des Humanen Papillomvirus (siehe Abbildung 2) mit Hilfe von typspezifischen Primern und Sonden spezialisiert ist. Mit Hilfe dieser Technologie kann z.B. das Risiko von falsch-negativen Testergebnissen, die mit dem Verlust der Virushülle (L1-Deletion) einhergehen, reduziert werden.

Ref.: 

1 Doorbar, J. (2006). Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer. Clinical science110(5), 525-541.

2 Bottari, F., Sideri, M., Gulmini, C., Igidbashian, S., Tricca, A., Casadio, C., ... & Sandri, M. T. (2015). Comparison of the performance of the BD Onclarity HPV Assay with Hybrid Capture II in detection of CIN2+ lesions. Journal of clinical microbiology, JCM-00246.


Indikationen der HPV Diagnostik

Bei auffälliger Zervixzytologie oder bei Zustand nach operativem (operativen) Eingriff(en) an der Cervix uteri wegen CIN I bis CIN III übernimmt die GKV die Kosten für den HPV-DNA Test

Indikationen der HPV Diagnostik

Immunzytochemische Methoden

Neben den HPV-Nachweismethoden können in der gynäkologischen Zytologie zur Bewertung und Analyse von unklaren Befunden und zur Bewertung von erkannten Dysplasien des Gebärmutterhalses ebenso wie zur Qualitätskontrolle in der zytologischen Diagnostik immunzytochemische Methoden verwendet werden. Wir verwenden den CINtec® PlusTest der Firma Roche Diagnostic Deutschland GmbH.

Dieses duale immunzytochemische Nachweisverfahren kann sowohl auf Basis des konventionellen Abstrichs als auch auf Basis der Dünnschichtzytologie durchgeführt werden.
Bereits im Labor gefärbte und befundete Pap-Abstriche, können für dieses Nachweisverfahren entfärbt werden. Im Anschluss durchläuft der Pap-Abstrich einen spezialisierten (immunzytochemischen) Färbeprozess.
Bei der Dünnschichtzytologie werden die Zellen erst im Labor aus der Transportlösung nach einem aufwendigen Filterprozess auf den Objektträger übertragen, anschließend gefärbt und bewertet. In der Regel bleibt ein Restvolumen an Zellen in der Transportlösung, die für das immunzytochemische Nachweisverfahren verwendet werden kann. Eine Entfärbung ist dann nicht notwendig. Das zweifache immunzytochemische Nachweisverfahren erkennt die körpereigenen Proteine p16-INK4a und Ki-67.

Abbildung 3: p16-INK4a Färbung
Abbildung 3: p16-INK4a Färbung

Das Zellprotein p16-INK4a hat eine Kontrollfunktion innerhalb des Zellzyklus. Unter physiologischen Bedingungen ist es gebunden. Liegt freies p16-INK4a vor, so kann dies in einen direkten Zusammenhang mit einer Veränderung der Zelle (Transformation) gebracht werden, die z.B. durch eine anhaltende Infektion mit Hochrisiko Humanen Papillomviren verursacht werden kann. Bei einem positiven Nachweis von p16-INK4a färbt sich das Zytoplasma der betroffenen Zelle braun (siehe Abbildung 3).

Abbildung 4: Ki-67 Färbung
Abbildung 4: Ki-67 Färbung

Der zweite Schritt des immunzytochemischen Nachweisverfahrens zielt auf das Zellprotein Ki-67. Dieses Protein kann während einer bestimmten Phase des Zellzyklus (Interphase) im Zellkern nachgewiesen werden und wird auch als Biomarker für die Zellproliferation bezeichnet. Sein positiver Nachweis führt zu einer Rotfärbung des Zellkerns (siehe Abbildung 4).

Abbildung 5: CINtec ® PLUS positiv: Cluster mit dual gefärbten Einzelzellen.
Abbildung 5: CINtec ® PLUS positiv: Cluster mit dual gefärbten Einzelzellen.

Normalerweise, unter physiologischen Bedingungen, kommen beide Proteine nicht innerhalb einer Zelle vor. Falls jedoch beide Proteine in einer Zelle nachgewiesen werden, so kann dies als Zeichen für eine weiter voranschreitende Läsion gedeutet werden (positives Testergebnis). Falls die Proteine nicht innerhalb einer Zelle nachgewiesen werden, ist das Testergebnis negativ. In diesem Fall ist die Rückbildung der beobachteten Läsion wahrscheinlich.

Der gleichzeitige Nachweis der Proteine p16-INK4a und Ki-67 in derselben Zelle ist ein Indikator für die Deregulation des Zellzyklus, in denen der onkogene Transformationsprozess durch HR-HPV begonnen haben kann.

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